公司动态
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做分子生物学实验，完整性好、纯度达标的RNA是RT-qPCR、转录组测序、miRNA分析等下游实验成功的首要前提。很多小伙伴在提取过程中频繁踩坑：RNA降解、浓度偏低、OD值异常、基因组DNA污染……今天我们分开讲解柱式法、磁珠法两套主流提取方案，包含原理、操作流程、实操细节以及高频问题排查方案，帮助大家稳定拿到高品质RNA！
柱式法RNA提取
柱式法提取原理
裂解液快速破碎细胞与组织样本，高浓度胍盐一方面能够使蛋白变性沉淀，另一方面强力抑制样本内源RNase活性；在高盐环境条件下，核酸中的磷酸基团可以和柱子中的硅胶膜发生特异性结合，DNA、蛋白质、多糖、色素等杂质无法被膜吸附，随废液被离心除去；随后使用低盐洗脱缓冲液，破坏RNA与硅胶膜之间的氢键吸附作用，将纯净RNA从吸附膜上洗脱收集。
优势
操作快速简便，无酚氯仿，适合常规手动提取；
硅胶膜特异性吸附，纯度高、重复性好；
针对细胞、组织、全血、植物、miRNA开发出专用试剂盒，常规离心机即可使用，下游实验稳定可靠。
柱式法基本操作流程
柱式法实操关键细节
1. 离体样本需要快速处理，动物组织优先液氮速冻或者直接浸入裂解液，最大限度减少RNA降解，样品应避免反复冻融，否则会导致提取量下降。
2. 植物、坚硬组织样本，需要提前充分研磨破碎，裂解不完全会直接造成RNA得率大幅下降。
3. 添加DNase I酶、洗脱液时，滴加一定要落在柱膜正中间，不要滴到管壁，静置2-3分钟再离心，有效提升洗脱效率。
4. miRNA属于小片段核酸（＜200nt），需要选用miRNA专用试剂盒。（如索莱宝货号：R2200、R2220、R2230）
磁珠法RNA提取
磁珠法提取原理
经过表面官能团修饰的磁性微球，可以在高盐环境下特异性吸附核酸分子；样本裂解完成之后，调节缓冲液盐浓度，RNA结合在磁珠表面，蛋白、多糖等杂质保留在液相中；借助磁力架吸附磁珠，弃掉废液，使用洗涤缓冲液多次清洗磁珠去除杂质；最后更换低盐洗脱液，RNA从磁珠表面解吸附，得到纯化核酸。
优势
悬浮式吸附，没有滤膜堵孔烦恼，细菌、高杂质样本提取稳定；
操作简单，用时短；
安全无毒，可完成自动化提取。
磁珠法基本操作流程
磁珠法实操关键细节
1. 磁珠使用前充分颠倒混匀，保证磁珠悬液均匀，在4℃保存，用量不足会直接降低RNA回收率。
2. 每一步磁力吸附时，等待液体完全澄清之后再吸走上清，避免磁珠损失。
3. 洗涤步骤重悬磁珠一定要充分，磁珠抱团会包裹杂质，造成RNA纯度下降。
4. 洗脱体积不要过小，过低体积容易造成磁珠随洗脱液被吸出。
RNA提取高频问题&解决方案
问题1：RNA电泳条带弥散、发生降解
原因：样本离体降解、耗材/环境携带RNase、裂解速度慢。
解决：样本及时液氮速冻，尽快和裂解液充分混匀，缩短常温操作时间；严防RNase污染，全程佩戴手套口罩，选用无RNase枪头、离心管；操作台提前使用去RNA酶试剂擦拭。
问题2：RNA浓度低，核酸得率不理想
原因：样本破碎裂解不完全、结合/洗脱步骤操作不当、磁珠添加量不足。
解决：避免样本反复冻融，提高样本破碎力度；严格遵守试剂配比；柱式法优化洗脱静置时间；磁珠法保证磁珠充分混匀。
问题3：OD???/???＜1.8，蛋白污染
原因：未充分洗涤。
解决：可增加一次洗涤步骤。
问题4：OD???/???比值偏低，盐类、
多糖杂质残留
原因：植物样本多糖多酚干扰，洗涤不够充分。
解决：植物样本选用R1230柱式法提取植物RNA试剂盒，必要情况下增加一次洗涤。
问题5：后续反转录、PCR实验失败
原因：乙醇有机溶剂残留。
解决：柱式法增加空柱离心时长；磁珠法充分挥发洗涤液残留。
相关实验数据
提取的洗脱体积均为 50μL，RNA 上样量 2-4μL，
琼脂糖凝胶浓度为 1%，125v 电泳 30min。
不同公司提取组织 RNA 核酸电泳胶图对比结果
组织RNA所得率
组织RNA qPCR溶解曲线
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