文献解读

文献背景

番茄是植物代谢与环境适应研究的理想模型，同时也是很有价值的果蔬作物。但追求高产导致现代品种耐旱性减弱，影响果实品质。酚酰胺是番茄的代谢物，具有抗氧化和清除自由基的特性，能减轻紫外线辐射和干旱的氧化应激。然而，酚酰胺对番茄耐旱性的影响研究尚少。酚酰胺的代谢和调节机制尚未明确。最近的研究将次生代谢物多样性（由多种途径的相关生物合成基因的共表达产生）与植物对环境胁迫的广泛反应联系起来。例如，由去饱和酶和脱羧酶基因簇编码的镰叶芹二醇会影响番茄对致病菌的抗性；由7号染色体上的6个邻近基因编码的甾体糖苷生物碱可以增强番茄对病原菌的抗性。因此，酚酰胺多样性（及其相关的环境适应性）也可能由生物合成基因簇决定。但番茄中酚酰胺的生物合成基因簇至今未见报道。

在这项研究中，海南大学三亚南繁研究院王守创团队在番茄中鉴定了两个新的生物合成基因簇(BGC)，并揭示了BGC11和BGC7在产生番茄酚酰胺多样性中的关键作用。此外，作者还发现SIMYB13正向调节BGC的表达和酚酰胺的积累，从而增强番茄的耐旱性。自然变异分析表明，BGC7、BGC11和SIMYB13在番茄驯化和改良过程中经历了强负选择，导致现代番茄品种的酚酰胺含量和耐旱性降低。该研究为番茄中酚酰胺的生物合成、多样性与调控、进化和生物学功能提供了新的见解。

基本信息

题目：

Two gene clusters and their positive regulator SlMYB13 that have undergone domestication-associated negative selection control phenolamide accumulation and drought tolerance in tomato

期刊：Molecular Plant

影响因子：27.5

PMID: 38327054

DOI: 10.1016/j.molp.2024.02.003

通讯作者：杨君，王守创

作者单位：

海南大学三亚南繁研究所

索莱宝合作产品：

摘 要

在植物代谢产物中，酚酰胺类物质是羟基肉桂酸衍生物和多胺的缀合物，在植物适应非生物胁迫和生物胁迫中发挥着重要作用。然而，关于酚酰胺代谢的分子机制及其调控机制以及驯化和育种对番茄酚酰胺多样性的影响尚不明确。在这项研究中，进行了基于代谢物的全基因组关联研究，并鉴定了两个包含12个参与酚酰胺代谢的生物合成基因簇(BGC7和BGC11)，其中包括4个生物合成基因（2个4CL基因、1个C3H基因和1个CPA基因）、7个修饰基因（5个AT基因和2个UGT基因）以及一个转运蛋白基因(DTX29)。通过基因共表达网络分析进一步发现，SIMYB13正向调节两个基因簇的表达，从而促进酚酰胺的积累。遗传学和生理学分析表明，BGC7、BGC11和SIMYB13通过增强活性氧清除能力和增加脱落酸含量来增强番茄的耐旱性。自然变异分析表明，BGC7、BGC11和SIMYB13在番茄驯化和改良过程中被负选择，导致栽培番茄的酚酰胺含量和耐旱性降低。总体上，该研究发现了番茄中酚酰胺生物合成和调控的关键机制，揭示了作物可以通过驯化和改良形成代谢多样性，进而影响植物对环境的适应性。

研究内容及结果

1.通过代谢组全基因组关联研究(mGWAS)鉴定出两个酚酰胺生物合成基因簇

作者为研究番茄驯化中酚酰胺含量（及其遗传基础），对401个番茄品种进行代谢分析。发现大多数酚酰胺丰度下降（图1A）。mGWAS揭示第11号染色体与diCou-Put和diCaf-Put相关，第7号染色体与FerCaf-Spd相关（图1B、C）。第11号染色体上的SNP(sf1154946315)附近鉴定出8个控制酚酰胺含量的基因，包括酰基转移酶、UDP-葡萄糖基转移酶等（图1B）。第7号染色体上围绕显著SNP(sf0703267875)发现4个基因，涉及酰基转移酶、4-香豆酸CoA连接酶及MATE基因（图1C）。这两组共定位的基因可能代表番茄中调节酚酰胺的生物合成基因簇，分别称为BGC11和BGC7。

为鉴定BGC11和BGC7中5个酰基转移酶、2个4-香豆酸辅酶A连接酶和2个糖基转移酶的生物学功能，克隆了这些候选基因的编码DNA序列(CDSs)。SIAT1.1、SIAT1.2和SIAT1.3表现出以腐胺为酰基受体和香豆酰辅酶A为酰基供体的酰基转移酶活性（图1D）。其中SIAT1.2可催化双酰基化（图1D）。SIDH29、SICV86分别催化酰基亚精胺生成Caf-Spd、diCaf-Spd（图1E）。在烟叶中，SI4CL1.1、1.2将香豆酸、咖啡酸分别转化为相应的辅酶A（图1F、G）。SIUGT93U2、93U3将Fer-Put转化为(Fer-O-Hex)-Put（图1H）。此外，SIC3H被证实能够生成咖啡酸（图1I）。

最后，进行了亚细胞定位分析以验证SIDTX29是否作为番茄中的酚酰胺转运体。在过表达SIDTX29的转基因番茄植株(SIDTX29-OE)中观察到了转运活性（图1J）。与野生型(WT)植物相比，SIDTX29-OE株系对Spd的敏感性更强，并且使用8D标记的Spd和液相色谱-质谱(LC-MS)证明其对Spd吸收活性也更高（图1K）。以上结果表明，BGC11和BGC7是两个新发现的酚酰胺生物合成基因簇。

图1|酚酰胺生物合成基因簇BGC11

和BGC7的鉴定

2. BGC11和BGC7对番茄中酚酰胺多样性的贡献

作者为探究BGC11和BGC7核心酶在番茄中的功能，构建了过表达SIAT1.1、SIAT1.2、SIAT1.3、SIDH29和SICV86的转基因番茄株系。代谢物分析显示，SIAT1.1/1.3-OE株系中单酰基化Put衍生的酚酰胺增加（图2A-B），而二酰基化的Put衍生酚酰胺在SIAT1.2-OE株系中过度积累（图2C）。随后研究发现CRISPR-Cas9生成的SIAT1.2突变株系(SIat1.2-CR)中二酰化酚酰胺减少，尤其diCou-Put减少近3倍（图2D），表明BGC11增强了Put衍生酚酰胺多样性。类似地，SIDH29-OE株系中单酰基化Spd衍生酚酰胺增加（图2E），而SICV86-OE株系中二酰基化Spd衍生酚酰胺积累更多（图2F），再次表明了Spd衍生酚酰胺的多样化。

为研究转运蛋白SIDTX29如何影响酚酰胺代谢，进一步使用LC-MS测定了酚酰胺积累。结果表明SIDTX29-OE品系中Caf-Spd、Fer-Spd和diCaf-Spd积累明显增加（图2G）。BGC7的四个基因共表达使烟叶中的Caf-Spd含量增加了35.4倍（图2H）。单独或共表达也导致Caf-Spd的积累显著增加（图2H）。研究表明BGC11与Put衍生的酚酰胺，BGC7与Spd衍生酚酰胺的生物合成与修饰、运输的关系（图2I）。以上发现强调了BGC11和BGC7这两个基因簇在番茄酚酰胺多样性中发挥的关键作用。

图2|番茄中酚酰胺生物合成、修饰和

转运的代谢网络

3. SlMYB13直接正向调控BGC11和BGC7中的基因表达，以促进酚酰胺的积累

接下来，作者通过分析两个BGC基因簇的表达谱，发现它们主要在根、花、叶、茎、果实中高度表达。荧光定量PCR 验证了二者的同步表达（图3A）。共表达网络分析表明SIMYB13与BGC7和BGC11在花、根中的表达模式的相关性较强。此外，SIMYB13和基因簇均因干旱胁迫和脱落酸(ABA)处理而上调，表明存在胁迫响应调节机制（图3B和3C）。

为了描述SIMYB13与BGC11和BGC7的12个基因之间的相互调控作用，进一步通过酵母单杂交试验证实了SIMYB13与基因启动子的直接相互作用（图3D）。SIMYB13-OE系显示BGC7和BGC11基因表达增加，Put衍生和Spd衍生的酚酰胺水平更高（图3E）。相反，SImyb13-CR系显示12个基因的表达减弱，且酚酰胺含量减少（图3F）。综上所述，SIMYB13正向调控番茄中的BGC11和BGC7，突出了其在促进酚酰胺积累中的作用。

图3|12个酚酰胺生物合成

基因的共同调控

4. BGC11、BGC7和SIMYB13通过促进番茄中酚酰胺的积累提高耐旱性

在进一步的研究中，作者使用表达SIMYB13和核心BGC基因的转基因品系开展干旱胁迫实验。结果表明SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE、SICV86-OE和SIMYB13-OE品系比WT植株更耐旱，其中SIAT1.2-OE特别耐旱（图4A和4B）；相比之下，SImyb13-CR系比WT植株对干旱胁迫更敏感（图4C）。在水分充足或干旱胁迫条件下，SIat1.2-CR系和WT植株之间没有显著差异（图4D-4F）。SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE系在干旱条件下比WT植株表现出更高的存活率和更高的相对含水量，而SImyb13-CR系则表现出相反的模式（图4E和4F）。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定和丙二醛(MDA)积累试验表明，与WT植物相比，SIAT1.2-OE和SIMYB13-OE植物的活性氧(ROS)清除能力增强，MDA积累减少（补充图）。这些结果表明BGC11、BGC7和SIMYB13可以增强番茄的耐旱性。

作者通过分析转基因植株在干旱胁迫下的ABA水平发现，SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE品系的ABA积累高于WT，而SImyb13CR品系中ABA积累较少（图4G）。通过RT-qPCR进行检测，结果表明，干旱胁迫后，ABA合成和信号转导相关基因在过表达品系中表达增加，而在SImyb13-CR中减少（图4H-I）。SIat1.2CR与WT在ABA含量或基因表达上无显著差异。因此，BGC11、BGC7和SIMYB13可以影响ABA含量。

进一步分析结果表明，干旱条件下SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE等植株中酚酰胺（如Fer-Put等）积累高于WT，而SImyb13-CR较低（图4J）。外源Fer-Put处理WT植物后，ABA含量显著升高（图4K），且相关基因表达也增加（图4L-M）。这表明酚酰胺积累（受BGC11、BGC7和SIMYB13调控）通过增强ROS清除能力和增加ABA来增强番茄耐旱性。

图4|BGC11、BGC7和SIMYB13在

番茄耐旱性中的作用

补充图|WT、SIAT1.2-OE和

SIMYB13-OE转基因植株中ROS

积累和ABA相关基因表达比较

5. 番茄驯化和改良过程中BGC11、BGC7和SIMYB13的自然变异

接下来，为探究BGC11、BGC7和SIMYB13的进化历史，作者比较了三个番茄亚组之间的核苷酸多样性(π)。在变异分析中，作者在SIMYB13的CDS区域内发现了一个与Fer-Put、diCou-Put和diCaf-Spd相关的非同义突变。基于该变异，番茄种群被分为两个单倍型组，即SIMYB13-T^HapA和SIMYB13-G^HapB。SIMYB13-G^HapB的Fer-Put(P = 2.36×10^-9)，diCou-Put（P = 3.15×10^-5）和diCaf-Spd（P = 2.15×10^-9）浓度显著高于SIMYB13-T^HapA，且在番茄驯化和改良过程中频率逐渐降低（图5A）。

同时，作者在烟叶中瞬时表达了SIMYB13-T^HapA和SIMYB13-G^HapB，并发现SIMYB13-G^HapB中酚酰胺的积累量更大（图5B）。此外，表达这两种单倍型的SIMYB13-OE株系比WT植株表现出更强的耐旱性；特别是SIMYB13-G^HapB，在干旱条件下保持了更强的ROS清除能力以及更低的MDA水平（图5C和5D）。以上结果表明，SIMYB13-G^HapB可以调节酚酰胺的积累，并在番茄驯化和改良过程中经历了负向选择。

基于上述结果，作者将六个基因单倍型组合为HapA、HapB和HapC三组。结果显示，HapB品种的酚酰胺积累量远高于HapA（图5F、G），耐旱性也更强（图5H）。经RT-qPCR和代谢组学分析证实，HapB中这些基因的转录本上调，酚酰胺积累量增加（图5I）。以上发现强调了HapB单倍型与酚酰胺含量增加的关联，HapB的消耗可能是导致番茄耐旱性降低的因素之一。

图5|番茄驯化过程中对BGC11、BGC7

和SIMYB13的逐步筛选

6. BGC11和BGC7在植物中的进化史

为了进一步探索BGC11和BGC7基因的进化历史，作者对30个具有进化代表性的物种进行了比较基因组分析。分析表明，发现CPA基因在藻类中存在且保守，而4CL、C3H和UGT基因源于陆生植物祖先。BGC11和BGC7核心基因仅存在于陆生植物中。BGC11和BGC7基因聚集在茄科植物中，马铃薯和番茄基因共线性较强。这些发现突出了酚酰胺BGCs在植物适应陆地环境及茄科植物保护中的重要性（图6）。

考虑到物种的系统发育和全基因组复制的历史，作者提出了一个进化模型来解释BGC11和BGC7基因簇的起源。1910万年前基因组重排影响BGC11，620万年前串联重复影响BGC7。这些发现表明，基因簇的形成和多样化依赖于结构变异和基因得失。在番茄驯化中，BGC11、BGC7和SIMYB13的HapB受负向选择，导致酚酰胺含量下降，影响耐旱性（图7）。

图6|BGC7和BGC11是茄科物种

基因簇

图7|两个驯化相关基因簇

（BGC11和BGC7）和SIMYB13

调节番茄耐旱性的示意图

结  论

在这项研究中，作者使用多组学方法鉴定并表征了两个以前未报道的茄科的酚酰胺生物合成基因簇（BGC7和BGC11）并发现了一条新的调控途径。其中SIMYB13特异性地结合到这两个基因簇中基因的启动子上。这有助于协调和高效地转录植物酚酰胺代谢途径基因，从而调节酚酰胺水平并增强番茄的耐旱性。研究结果表明，在番茄中过表达BGC11、BGC7和SIMYB13增强了耐旱性，这可能部分归因于酚酰胺水平较高和抗氧化活性增强。此外，应用与耐旱性相关的代表性酚酰胺—外源性Fer-Put，也增加了ABA含量，这表明酚酰胺可以用作保护剂，使植物能够在短期干旱中存活。在这项研究中，通过在烟叶中共表达BGC7基因，酚酰胺含量最高增加了35倍。这表明鉴定出的基因簇（BGC7和BGC11）代表了番茄中酚酰胺含量的新育种靶标，以及一种异源合成酚酰胺的途径，使降低生产成本并使外源喷洒成为可能。该研究描述了一种与高酚酰胺积累相关的自然单倍型HapB，在番茄驯化和改良过程中受到负向选择，从而影响了番茄的耐旱性。因此，HapB可作为与番茄耐旱性相关的遗传标记，用于番茄育种。为了提高番茄的耐旱性以及种子数量和发芽率，可以使用特定的干旱诱导型启动子来控制BGC11、BGC7和SIMYB13的组合HapB单倍型的表达，以重新引入现代番茄品种。这种策略不仅可以提高现代商业番茄和传统品种的耐旱性，还可以确保它们在非胁迫条件下能够正常生长。酚酰胺在提高作物耐旱性方面发挥着至关重要的作用，利用酚酰胺代谢途径可能有助于最大限度地提高干旱地区作物的耐旱性。

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