文献背景

脓毒症是一种多因素疾病，常继发于感染，可导致多器官功能障碍。妊娠引起的生理变化使个体容易出现脓毒症，并带来更高的死亡风险。然而，造成死亡率增加的机制尚不清楚，针对怀孕脓毒症患者缺乏适当的治疗方法。因此，确定脓毒症患者全身免疫紊乱的机制是揭示改善产妇和新生儿健康的潜在治疗方法。肠道菌群由数万亿细菌组成，能调节感染引起的多器官衰竭的易感性。肠道菌群调节疾病病理的主要机制包括：(1)肠道上皮屏障破坏引起的肠漏的发生，(2)肠道内细菌代谢产物或外膜囊泡的分泌，(3)肠道菌群代谢物耗竭还原型谷胱甘肽，从而介导对乙酰氨基酚诱导的肝毒性的昼夜变化。此外，肠道细菌来源的格拉司琼通过重新编程巨噬细胞因子反应来保护脓毒症诱导的肝损伤。怀孕改变了肠道微生物菌群的组成，使宿主容易出现代谢综合征。因此，作者假设产妇脓毒症的高死亡率与肠道微生物菌群失调有关。

异质核糖核蛋白U-like protein 2（hnRNPUL2）作为一种RNA结合蛋白可以稳定长非编码RNA结直肠肿瘤的差异表达（CRNDE），并激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，以促进结肠癌的发生。本研究中，作者想要研究肠道微生物菌群失调在脓毒杆菌宿主免疫功能障碍中的作用。利用细菌中的同源重组，作者证明在怀孕期间微生物释放刺芒柄花素(FMN)减少。妊娠引起的肠道菌群紊乱增加了脓毒症的易感性，这是由于细胞核中hnRNPUL2的积累导致巨噬细胞凋亡，这为限制脓毒症严重程度的潜在疗法提供了线索。

基本信息

题目：

Pregnancy-induced changes to the gut microbiota drive macrophage pyroptosis and exacerbate septic inflammation

期刊：

Immunity

影响因子：32.4

PMID：

36792573 

通讯作者：

龚神海 姜勇 肖炜

作者单位：

南方医科大学

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摘要

脓毒症系指宿主对病原体感染的免疫反应失调引起危及生命的全身炎症反应综合征，是妊娠期女性患者入院产科ICU的主要病因，常常导致新生儿发育畸形、早产以及流产等严重后果，也是全球孕产妇死亡的主要原因。

研究人员利用多组学测序和同源重组技术对妊娠期女性和小鼠肠道细菌研究发现，粪副拟杆菌(Pmerdae)及其衍生代谢物刺芒柄花素(FMN)的含量降低，由此导致妊娠期宿主的巨噬细胞大量死亡、机体免疫力下降，从而增加了妊娠期宿主对脓毒症的易感性。FMN属于常见的中药单体，具有益气养阴的功效。本研究发现FMN能够抑制脓毒症宿主的大量腹腔巨噬细胞发生焦亡，增加腹腔巨噬细胞数量以杀灭入侵的病原体，从而降低脓毒症的死亡率。

此外，该团队通过蛋白质组学和表面等离子体共振技术成功鉴定巨噬细胞内异质核糖核蛋白UL2(hnRNPUL2)作为FMN的负向调控蛋白受体，在脓毒症期间由胞内移位至胞核并结合Nlrp3基因启动子区域，启动焦亡相关基因表达，引起巨噬细胞焦亡，而敲低hnRNPUL2表达，能够防止脓毒症小鼠的多器官功能衰竭并降低死亡率。临床研究也发现，脓毒症患者粪便P.merdae和FMN含量与患者疾病进展呈现出负相关。

该研究揭示了孕产妇体内“P.merdae-FMN-hnRNPUL2”的微生物免疫轴在脓毒症期间的重要生物学意义，为开发妊娠期脓毒症所致的免疫紊乱的精准治疗方案提供了新的策略。

研究内容及结果

1.妊娠加重了脓毒症

比较妊娠小鼠（P）和未妊娠小鼠（NP）在盲肠结扎和穿刺（CLP）后36小时的总死亡率。与NP组相比，P组CLP后死亡率显著升高（图1A）。同样的结果也出现在脂多糖刺激小鼠组，CLP后，P组小鼠的血浆丙氨酸转氨酶（ALT）、肌酐（Cr）浓度以及支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总蛋白含量高于NP小鼠（图1B）。组织病理学检查显示，与NP小鼠相比，P小鼠出现了更严重的多器官损伤（图1C和1D）和细胞死亡（图1E和1F）。作者量化了P组CLP小鼠血浆和腹腔灌洗液（PLF）中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度，发现大多数细胞因子在P组CLP小鼠中升高（图1G和1H）。通过qRT-PCR比较PLF和BALF细胞的细胞因子和趋化因子，发现CLP后P小鼠的TNF-α、IL-1β、Il-6、Ccl2、Ccl3和Cxcl2 mRNA转录量高于NP小鼠。妊娠增强了CLP诱导的不同组织的局部炎症反应，从而增加了细胞因子和趋化因子的mRNA（图S1C）。虽然P和NP小鼠的粪便总菌量没有统计学差异(图S1D)，但P组CLP小鼠的血液和PLF中的活细菌增加（图1I）。16S分析结果与P组CLP小鼠血液和PLF的细菌培养结果一致(图S1E)。P小鼠对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）引起的肺炎也表现出更强的易感性，表现为生存期缩短，肺损伤加重，以及强烈的局部和全身炎症（图1J和S1F-S1J）。妊娠通过加重炎症反应和抑制病原体清除能力，增加了脓毒症诱导的多器官衰竭的易感性。

图1

2.脓毒症死亡率的增加与肠道菌群有关

作者为了排除肠道感染源的改变可能直接导致妊娠期CLP诱导的脓毒症易感性增加的可能性，从NP和P小鼠中分离了盲肠细菌。分别腹腔注射来自NP和P小鼠的盲肠细菌混合物（CBMs）诱导的两组脓毒症小鼠均表现出相似的易感性（图2A，S2A和S2B）。通过给广谱抗生素（ABX）预处理3天耗尽肠道微生物群，然后对小鼠进行CLP或LPS处理，给药ABX的肠道菌群缺失在NP和P小鼠间没有引发任何病理变化（图2C），在生存曲线统计学上无明显差异（图2B和2C）。作者对怀孕个体进行了粪便菌群移植（FMT）。接受NP供者粪便的NP小鼠比接受P供者粪便的NP小鼠对脓毒症的抵抗力更强（图2D-2F）。此外，接受P供体粪便的NP小鼠在脓毒症期间具有更高的血清ALT活性和BALF总蛋白含量（图2G）。在脓毒症反应中，接受怀孕供者粪便的NP小鼠比接受NP供者粪便的NP小鼠发生更严重的器官损伤。此外，在CLP后6小时，接受P供者粪便的NP小鼠的血浆细胞因子浓度高于接受NP供者粪便的NP小鼠（图2H）。P组粪便微生物群的移植也加速了铜绿假单胞菌感染引起的脓毒症小鼠的死亡。相反，与接受P个体粪便的P小鼠相比，NP个体的粪便移植降低了脓毒症的高死亡率。总的来说，怀孕期间微生物组的变化足以导致脓毒症的增加。

图2

3.妊娠期间粪副拟杆菌和FMN丰度降低

16S rRNA基因测序显示，肠道微生物群存在明显的组间分离（图3A和3B）。此外，怀孕引起了肠道微生物群组成的变化。线性判别分析（LDA）表明，怀孕女性和小鼠共性只有粪副拟杆菌呈下降趋势（图3C和3D）。主成分分析（PCA）显示P小鼠肠道菌群代谢谱发生了显著变化（图3E）。火山图和热图分析显示，强效抗炎剂FMN在P小鼠中的水平较低（图3F和S4E），靶向液相色谱—串联质谱分析进一步证实了这一点（图3G）。与NP组相比，P组女性的FMN较少（图3H）。

4.来自粪副拟杆菌的β-D-半乳糖苷酶是肠道中FMN的关键贡献者

用ABX处理的小鼠中观察到FMN浓度降低，这表明FMN的产生依赖于肠道微生物群（图S4F）。通过综合多组学分析，证实了样本中粪副拟杆菌丰度与FMN丰度之间的相关性（图3I）。此外，P组粪副拟杆菌的丰度在怀孕的人和小鼠中都有所下降，而其他物种的丰度没有下降（图3J，3K，S4G和S4H）。在CLP小鼠的PLF中，粪副拟杆菌丰度降低。为了进一步阐明FMN的产生机制，将P组粪副拟杆菌进行了全基因组测序，发现该菌株的基因组包含13个ORF编码不同β-半乳糖苷酶家族成员（图S4K）。β-D-半乳糖苷酶能以钙依赖的方式促进小鼠FMN的释放（图3L）。NP和P小鼠的食物摄取量相似，FMN的差异主要来自于肠道中粪副拟杆菌数量。在粪副拟杆菌的基因组中存在4个编码β-D-半乳糖苷酶成员；然而，只有ORF01166具有典型的N端信号肽，用于分泌在Ser26处有切割位点（图3M、3N和S4N）。利用同源重组技术制备了P组粪副拟杆菌菌株ORF01166缺陷突变体（图S4O）。缺失该基因可阻断β-半乳糖苷酶的分泌和FMN的产生（图3O-3Q）。野生型粪副拟杆菌预处理的脓毒症小鼠的FMN浓度升高，而β-D-半乳糖苷酶缺陷突变株的FMN浓度没有升高（图4A）。随着粪副拟杆菌减少，妊娠导致脓毒症小鼠PLF中FMN浓度降低，表明P组粪副拟杆菌通过妊娠期间FMN的减少参与脓毒症的进展。

图3

5.粪副拟杆菌或FMN治疗可减轻P和NP小鼠的脓毒症的相关炎症

ELISA检测发现经粪副拟杆菌灌胃预处理的NP组CLP小鼠血浆和PLF中TNF-α、IL-1β和IL-6均降低（图4B和S5A）。同样，粪副拟杆菌预处理分别提高了NP内毒素小鼠和P组CLP小鼠的存活率（图4C和S5B）。FMN单独处理不会对NP小鼠产生毒性。FMN抑制了血浆ALT、天冬氨酸转氨酶（AST）、Cr浓度和髓过氧化物酶（MPO）活性，并提高了CLP小鼠的存活率（图4D和4E）。FMN减少了CLP小鼠肝、肾和肺的病变和细胞死亡（图4F-4I）。FMN降低了CLP小鼠肺中CD11b+细胞的浸润，这与血清中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度的降低一致。FMN降低了CLP小鼠PLF和血液中的细菌数量（图4J）。与FMN处理小鼠相比，对照组小鼠在LPS处理后出现更严重的脓毒症。粪副拟杆菌中β-D-半乳糖苷酶基因缺失破坏了其对CLP小鼠MOF的预防作用（图4K）。综上所述，数据表明粪副拟杆菌或FMN对脓毒症小鼠具有保护作用。

图4

6.肠道菌群失调与妊娠期脓毒症免疫功能障碍有关

经CLP或LPS处理的P小鼠PLF中巨噬细胞和中性粒细胞数量减少（图5A和S6A）。经ABX预处理后，P型和NP型脓毒症小鼠PLF中巨噬细胞和中性粒细胞数量相似（图5B和S6B）。此外，与接受NP供者粪便的小鼠相比，预先给予P供者粪便的脓毒症小鼠PLF中的巨噬细胞和中性粒细胞数量减少（图5C，S6C和S6D）。此外，小鼠气管内感染铜绿假单胞菌的血液中单核细胞和中性粒细胞的减少取决于妊娠期间肠道微生物群的失调，肠道菌群失调会促进脓毒杆菌小鼠的免疫功能障碍。

7.FMN可消除脓毒症小鼠巨噬细胞的减少

巨噬细胞的耗竭不仅加速了脓毒症小鼠的死亡，而且降低了FMN诱导的对脓毒症的保护作用（图5D）。无论给药与否，巨噬细胞耗竭都加剧了脓毒症小鼠的多器官衰竭指数（图5F和S6N）。无论给药与否巨噬细胞耗竭损害了细菌清除，导致CLP小鼠血液中细菌负荷和PLF升高（图5H）。正如研究者所预期的，粪副拟杆菌和FMN均能增加脓毒症小鼠腹膜巨噬细胞的数量（图5I和5J）。FMN能够通过抑制免疫功能障碍来促进细菌清除，从而降低脓毒症小鼠的死亡率。

图5

8.FMN抑制脓毒症中巨噬细胞焦亡

妊娠增加了CLP小鼠腹腔巨噬细胞的细胞死亡（图6C），在接受P粪便的脓毒症小鼠中观察到类似的结果（图6D）。FMN可降低CLP小鼠PLF中巨噬细胞死亡（图6E）。用抑制剂VX765治疗的脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞数量增加(图6F)，而用其他细胞死亡抑制剂治疗的小鼠腹腔巨噬细胞数量没有增加(图S6P)。转录组分析显示，FMN改变了LPS + ATP处理的BMDMs的基因表达谱和NOD样受体信号通路(图S6Q和S6R)。FMN给药后，BMDMs中含有由LPS和ATP诱导的CARD (ASC)寡聚的凋亡相关斑点状蛋白被抑制（图6K和6L）。VX765极大地抑制了BMDMs的凋亡，而FMN没有表现出额外的抑制作用（图S6T和S6U）。FMN除巨噬细胞增加外，巨噬细胞的吞噬能力也明显增强（图S6V和S6W）。

图6

9.核hnRNPUL2通过结合Nlrp3启动子诱导巨噬细胞凋亡

蛋白质组学分析显示，RNA结合蛋白hnRNPUL2是在LPS + ATP处理的BMDMs中FMN给药后减少最多的蛋白(图7A)。使用RNA干扰技术稳定地降低了hnRNPUL2在BMDMs中的表达(图S7B)。hnRNPUL2的基因沉默导致ASC寡聚化的抑制和细胞死亡的减少(图S7C-S7F)。免疫沉淀分析显示FMN在体外直接与hnRNPUL2相互作用(图S7H)。荧光染色显示，FMN增强了hnRNPUL2和溶酶体在LPS + ATP处理的BMDMs中的共定位。hnRNPUL2直接与BMDMs中Nlrp3的启动子区结合(图S7K)。FMN显著降低了LPS + ATP处理Raw264.7细胞中Nlrp3启动子的转录活性(图S7L)。

10.粪副拟杆菌的菌群失调通过FMN-hnRNPUL2-NLRP3轴增强了脓毒症的易感性

腺相关病毒沉默了小鼠hnRNPUL2(AAV)介导的传递技术(图S7M)。hnRNPUL2的遗传沉默改善了CLP小鼠的存活率和减毒MOF(图7M、7N和S7N)。粪副拟杆菌的丰度与脓毒症患者血浆降钙素原(PCT)和Cr浓度呈负相关(图7O)。同时，脓毒症患者肠道FMN含量与血清ALT和AST浓度呈负相关(图7P)。综上所述，揭示了粪副拟杆菌的菌群失调在介导免疫轴FMN-hnRNPUL2-NLRP3中的意义，该轴通过诱导脓毒症患者巨噬细胞焦亡进而引起免疫功能障碍。

图7

结论

本实验中，研究人员使用抗生素治疗和粪便微生物转移，发现在小鼠和人类中，脓毒症易感性是由妊娠引起的菌群变化驱动的。综合多组学和细菌基因工程学研究表明，妊娠期肠道粪副拟杆菌(P. merdae)的数量降低导致了FMN的降低和巨噬细胞死亡的增加。从机制上讲，FMN通过抑制hnRNPUL2的积累以及与NLRP3启动子的结合来抑制巨噬细胞焦亡。用FMN治疗或敲除小鼠hnRNPUL2可防止感染性炎症。P. merdae和FMN的肠道含量与脓毒症患者的进展呈负相关。总之，揭示了在妊娠脓毒症宿主中被破坏的微生物免疫途径，突出了FMN-hnRNPUL2-NLRP3在脓毒症治疗方面的潜力。

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