荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键化学结构的化合物，当受到某一波段光照射时激发成为激发态，当从激发态恢复基态时可发出荧光。荧光标记技术是将荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记具有的无放射物污染、操作简便等优点，使其在许多研究领域的应用日趋广泛，如免疫病理、细胞化学、流式细胞学。

索莱宝SAlexa Fluor荧光素抗体标记试剂盒中的SAlexa Fluor荧光素连接有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯，NHS酯可以和伯胺反应，形成稳定的共价酰胺键并释放出NHS基团。一般一个IgG分子结合2~8个SAlexa Fluor荧光素分子可达到良好的荧光标记效果。

产品信息

试剂盒组分

试剂盒规格

一个试剂盒可标记100μg~2mg抗体

使用说明

01

抗体准备

1

建议抗体浓度调整到1~2mg/mL。

2

使用本试剂盒标记的抗体溶液，pH在6.5~8.5为宜，最好为PBS缓冲液。缓冲液中不应当含有BSA等蛋白，也不应当含有甘氨酸或Tris等含有游离氨基的盐类，否则可能会影响标记效果。

02

抗体标记

1

取出SAlexa Fluor染料离心数秒，将管中干粉甩至管底。注：未离心前请勿开盖，以免造成损失。

2

SAlexa Fluor管中加入40mL DMSO用漩涡混匀仪混匀10~20s，至SAlexa Fluor全部溶解，瞬离5~10s，使溶解后的SAlexa Fluor溶液离心至管底。

3

抗体中加入1/10体积的调整缓冲液。

4

将溶解后的SAlexa Fluor加入抗体中(每0.1mg抗体中加入2mLSAlexa Fluor)，用移液枪反复吹打混匀或用漩涡混匀仪混匀10~20s。

5

将抗体与SAlexa Fluor混合物置水平摇床或旋转混匀仪，在摇动状态下室温避光反应1~2小时。

03

游离SAlexa Fluor染料的去除

1

将纯化柱下方堵头掰断，1000×g离心1 min倒掉保护液，将纯化柱移至新的收集管中。

2

将0.2 mL PBS加入管中，待全部渗入填料后，1000×g离心1min，重复2次。

3

将标记反应液加入到纯化柱填料表面。如果样品体积小于50mL，用试剂盒中的PBS补齐至50mL。上样体积最大不要超过200mL。

4

待样品渗入填料后，1000×g离心2min，收集纯化的蛋白溶液。

5

将抗体标记物4℃避光保存待用。

04

标记抗体保存

标记抗体可4℃避光保存，也可以根据需要选择加入BSA、防腐剂、甘油等成分保证产品稳定。

*推荐保存液：0.01M PBS(pH7.4) 含1%BSA,0.03%

Proclin300和50%甘油，可-20℃保存一年。

05

染料-蛋白质比率的计算

1

用PBS稀释少量标记蛋白。

2

使用路径长度为1cm的比色皿，在280nm处测量吸光度和特定染料的Amax（见附表）

3

计算蛋白质浓度

C(mg/mL)={[A280-(Amax× Cf)]/1.4}×稀释因子。

√C是染料-蛋白共轭物浓度；

√A280和Amax分别是在280nm处的吸光值以及在Amax波长处的吸光值；

√Cf是染料校正因子见附表；

√稀释因子是在光度测量时的稀释倍数

4

计算标记率的方法如下

DOL=(Amax×Mwt×稀释因子）/(ε×C)

√C是染料-蛋白共轭物浓度；

√Mwt是IgG的分子量；

√ε是染料的摩尔吸光系数见附表。

注意事项

1. NHS酯类染料对水分敏感，SAlexa Fluor需现用现配；

2. 低浓度的叠氮钠（0.02%）和10%甘油不会明显干扰蛋白质的标记。但含有氨基的溶液及大于10%甘油对抗体的标记效率有较大影响。标记前应尽量去除干净；

3. 试剂盒组份在运输过程中可能造成颠倒，会使液体或干粉试剂沾到管壁或瓶盖上。使用前请离心处理，以使附着管壁或瓶盖的液体或干粉试剂沉积到管底；

4. DMSO属微毒类，对人体皮肤有渗透性，眼有刺激作用，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

附表

*：以nm为单位的激发波长

ε：Amax时的摩尔消光系数(M^-1 cm^-1)

Cf：校正系数(A280/Amax)

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