文献背景

纤维化或无序的纤维组织形成，是由异常的成纤维细胞激活，过度的细胞外基质（ECM）重塑引起，可导致多器官功能障碍。小分子药物如吡非尼酮和尼达尼布进行抗肝纤维化治疗的临床疗法具有适度的疗效、有限的适应症和严重的副作用，因此迫切需要针对纤维化的替代临床干预疗法。

肌成纤维细胞的激活和增殖在纤维化形成中具有核心作用，特异性阻断肌成纤维细胞的激活是一种很有潜力的疗法。TGF-β、IL-11、IL-13和IL-17等细胞因子已被证明在介导纤维化中发挥关键作用。虽然一些抗细胞因子疗法如托珠单抗注射液已被美国食品和药物管理局批准，取得了良好的临床效果，但仍有部分患者临床疗效不佳。失败的主要原因是纤维化疾病涉及多种细胞因子，单纯抑制一种或几种细胞因子可能是不够的，或者靶外抑制这些细胞因子可能会引起严重的副作用。因此下一代治疗有望使用局部应用的抗细胞因子策略来靶向整体纤维化微环境。

基于自体皮肤成纤维细胞的治疗来有效地减弱多器官纤维化。灭活的自体皮肤成纤维细胞具有完整的膜受体，制备简便，经济可行。内源性受体可以识别、隔离和清除某些细胞因子，可以调节细胞因子的活动，但不能触发信号转导（图1a）。成纤维细胞膜包裹聚乳酸-乙醇酸（PLGA）纳米颗粒（FNPs）来增强稳定性和促进给药。体外检测多种促纤维化细胞因子与FNPs的竞争结合，三种不同器官纤维化（肝纤维化、肺纤维化和心脏纤维化）的动物模型证实FNPs在体内具有抗纤维化效果，表明其具有良好的临床潜力（图1b）。

图1

基本信息

题目：

Autologous Skin Fibroblast-Based PLGA Nanoparticles for Treating Multiorgan Fibrosis

期刊：

Advanced Science

影响因子：17.521

PMID：

35603964

通讯作者：

叶晓峰 Hélder A. Santos 魏晓丽 赵强

作者单位：

上海交通大学医学院瑞金医院

W .J. Kolff生物医学工程和材料科学研究所格罗宁根大学医学中心

复旦大学基础医学院

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摘要

纤维化的一个特征是肌成纤维细胞的异常激活和积聚，这是由过量的促纤维化细胞因子引起的。传统的抗细胞因子疗法因单纯阻断一种或几种抗纤维化细胞因子并不能消除促纤维化的微环境而无法进行临床试验。本文基于自体皮肤成纤维细胞的仿生纳米颗粒来中和多种成纤维细胞靶向的细胞因子。将皮肤成纤维细胞膜融合到聚乳酸-乙醇酸上形成成纤维细胞膜包裹纳米颗粒（FNPs）。FNPs可以有效清除TGF-β、IL-11、IL-13和IL-17等各种促纤维化细胞因子，从而调节促纤维化的微环境。在三种不同器官纤维化（肺纤维化、肝纤维化和心脏纤维化）的动物模型中，FNPs可有效减少肌成纤维细胞的积聚和纤维组织的形成，同时恢复器官功能，表明FNPs是一种潜在的治疗纤维化的方法。

研究内容及结果

1.FNPs的制备与表征

皮肤成纤维细胞表达IL-11RA、IL-13RA、IL-17RA和TGF-β RII等多种细胞因子受体（图1c）。FNPs具有球形的核-壳结构，比未包裹的PLGA纳米粒子大20 nm（图1d-f）。FNPs具有与成纤维细胞囊泡相似的表面电荷，其聚合物分散性指数（PDI）为0.18（图1e，g）。与PLGA相比原代心脏成纤维细胞和巨噬细胞对FNPs的摄取均显著降低（图1h，i）。FNPs含有TGF-β RII、IL-11RA、IL-13RA和IL-17RA多种负责细胞因子结合的受体，而RNPs作为FNPs的对照，低表达或不表达上述细胞因子受体，FNPs以剂量依赖的中和这四种细胞因子（图1j，k）。

2.FNP抑制TGF-β1-诱导的肌成纤维细胞分化

TGF-β1刺激静息肺成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），形成应力纤维（图2a）。FNPs可明显改善TGF-β1诱导的成纤维细胞活化的刺激效应，α-SMA表达减少和应力纤维形成，但RNPs没有细胞因子中和作用（图2a-c）。TGF-β1可增强肺成纤维细胞的增殖能力、收缩能力和迁移能力，FNPs存在时TGF-β1诱导的上述效应被显著抑制，且在RNPs中略强（图2d-f）。TGF-β1刺激下NMuMG细胞间黏附连接被破坏，E-钙粘素表达下调，α-SMA表达增加，F-肌动蛋白从皮质重排为应力纤维分布（图2g，h）。TGF-β1还增强了ACTA2、Vimentin、Col1a1和MMP9的mRNA的表达（图2i）。将FNPs添加到培养基中可以减弱这些影响，而RNPs没有减弱效果（图2g-i）。

图2

3.气管内注射FNPs改善博莱霉素诱导的肺纤维化

小鼠每5天通过微喷雾器气管内吸入FNPs（50 μL，2 mg/mL）、RNPs或PBS溶液，直到观察结束（图3a）。FNP治疗显著延长了小鼠总生存率（FNP：65%，PBS：30%，RNP：35%）（图3b）。第21天时，对照组小鼠有严重的肺损伤和纤维化，而FNP组小鼠的肺损伤和纤维化明显减弱（图3c，d）。通过用力肺活量、肺顺应性、用力呼气量等监测，FNP处理的小鼠的肺功能也得到了保护（图3e）。损伤21天后，对照组小鼠肺泡结构严重扭曲，形成蜂窝状纤维团块，FNP治疗有效地减少了纤维化面积，并保留了正常的肺泡结构（图3f，g）。博莱霉素增加了肺组织中α-SMA和I型胶原的染色，FNP组显著减少，但RNP组没有显著减少（图3f，h）。FNP组小鼠肺中纤维连接蛋白、I型胶原和α-SMA显著减少（图3i，j）。FNP组TGF-β1的水平显著降低（图3k，l），FNP可降低FSP-1阳性细胞百分率和FSP-1/α-SMA双阳性细胞百分率（图3m，n）。

图3

4.静脉注射FNPs改善四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化

小鼠注射6周CCl₄诱导肝纤维化，每7天接受一次FNPs、RNPs或对照治疗（图4a）。随着纤维化的发展，对照组肝脏回声的强度和不均一逐渐增强，在门静脉区附近观察到大范围的纤维带，每周静脉注射FNPs有效地减缓了肝纤维化的进展，肝脏回声减少且更加均匀（图4b，c）。FNP组的血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶浓度降低，FNPs治疗显著减少了纤维化区域，下调了α-SMA表达、I型胶原沉积（图4d-f）。FNPs可降低促纤维化、促炎症和细胞外基质交联相关基因的表达，并恢复肝脏代谢基因的表达（图4g）。FNPs抑制了细胞因子-细胞因子受体的相互作用、趋化因子的产生和炎症反应相关的基因表达，并恢复了肝脏代谢（包括脂肪酸、胆汁酸、糖原、酪氨酸和药物代谢）相关分子数据库（MSigDB）的相关基因表达（图4h，i）。

图4

5.心肌内注射FNP-海藻酸盐水凝胶减轻局部成纤维细胞活化和胶原沉积及胶原亚型改变

FNPs与海藻酸钙悬浮液相互作用形成离子桥制备FNP-海藻酸盐水凝胶复合材料（图5a）。FNPs在藻酸盐支架中均匀分布，具有比粘性模量（G″）值高约10倍的恒定弹性模量（G′）（图5b，c）。FNP-AH组G′值随应变增加而快速下降，具有高结合能力，但AH和RNP-AH对TGF-β1、IL-11、IL-13和IL-17的结合能力不足（图5d，e）。急性炎症中成纤维细胞增殖并被激活，导致大量α-SMA阳性肌成纤维细胞在梗塞区域聚集，但邻近FNP-AH注射部位的区域α-SMA阳性细胞的数量显著减少（图5f，g）。胶原沉积在邻近FNP-AH注射部位的区域也显著减少（图5h，i）。FNP-AH组弹性Ⅲ型胶原纤维比刚性I型胶原纤维的百分比更高（图5j，k）。

图5

6.FNP-AH复合材料改善心肌梗死后的心脏功能、减少纤维化面积和限制了心脏重构

结扎前降支冠状动脉诱发心肌梗死，在缺血区和边缘区多点注射FNP-AH、RNP-AH或AH来诱导MI（图6a）。FNP-AH可改善心肌梗死组的生存，但AH或RNP-AH不能改善生存（图6b）。MI后心室损害的改善保持了四周（图6d）。左心室扩张在FNP-AH组中也得到显著预防，FNP-AH组中心肌细胞存活率显著增加（图6e-g）。FNP-AH组纤维化显著改善，AH和RNP-AH组也有中度改善，FNP-AH、RNP-AH和AH组的室壁厚度明显高于MI组（图6h-j）。与MI组相比FNP-AH组的杨氏模量显著降低，RNP-AH组和AH组的杨氏模量中度降低（图6k，l）。FNP-AH组边缘的心肌细胞的横截面积明显低于其他组（图6m，n）。

图6

结论

该研究开发了一种基于自体皮肤成纤维细胞生产抗纤维化药物的简便方法，在细胞资源、成本和时间方面具有明显优势。对MI高风险的患者可以预先建立细胞库来收集皮肤成纤维细胞，生产足量成纤维细胞衍生膜用于个体化FNP治疗，来自诱导多能干细胞的成纤维细胞可用于为急性损伤患者制造FNPs。为进一步促进其临床转化，应继续研究其在逆转纤维化中的潜在作用，通过遗传方法扩大细胞膜的中和能力，并在其他纤维化模型中测试其治疗效果。

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