文献背景

结直肠癌（CRC）是世界上常见和第二致命的恶性肿瘤。其中，70%以上的CRC死亡率由CRC肝转移（CRCLM）引起。血管生成抑制剂贝伐单抗常用于CRCLM的治疗。然而，内源性和获得性耐药性经常发生，导致治疗失败和癌症复发。CRCLM主要包含三种不同的组织病理学生长模式（HGP）：促结缔组织增生型（DHGP）、推进型（PHGP）和替换型（RHGP）。这些生长模式具有不同的组织病理学特征，并利用不同的方式获得血管供应。DHGP和PHGP以血管生成为肿瘤的主要供血方式。对于RHGP，肿瘤细胞浸润肝薄壁的肝板并绑架已经存在的窦状血管，这称为血管劫持。血管劫持被认为是介导CRCLM抗血管生成治疗耐药的重要机制，但其分子机制尚不清楚。目前，一些研究主要集中于“劫持者”肿瘤细胞方向，“被劫持者”血管基质细胞（窦状毛细血管）对血管劫持的作用机制仍然未知。

肝星状细胞（HSC）在CRCLM的病理过程中起着关键作用。CRC细胞分泌多种生长因子，包括转化生长因子-β（TGF-β），以激活HSC，HSC反过来分泌趋化因子、细胞因子、生长因子或蛋白酶，以促进肿瘤生长、转移、血管生成和免疫逃逸。从HSC的角度阐明血管劫持的分子机制将为新的靶向治疗策略提供线索，以克服血管劫持介导的抗血管生成药物的耐药性。

成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）是一种II型整合型膜丝氨酸蛋白酶，具有内肽酶活性，能够特异性切割N-末端苄氧羰基阻断（Z阻断）Gly-Pro（Z-GP）二肽连接底物。其特殊的二肽底物水解活性及其在肿瘤微环境中的限制表达使其成为酶激活前药物策略的理想靶点。用FAPα激活的前体药物Z-GP-DAVLBH靶向FAPα⁺HSC有效克服了血管劫持介导的CRCLM抗血管生成治疗的耐药性。

基本信息

题目：

Targeting FAPα-expressing hepatic stellate cells overcomes resistance to anti-angiogenics in colorectal cancer liver metastasis models

期刊：The Journal of Clinical Investigation

影响因子：19.456

PMID：35951441

DOI：10.1172/JCI157399

通讯作者：

张冬梅，叶文才，陈敏峰

作者单位：

暨南大学

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摘要

血管劫持已被证明可介导结直肠癌肝转移（CRCLM）对抗血管生成治疗的耐药性。目前血管劫持机制的研究主要集中在“劫持者”肿瘤细胞本身的变化，而“被劫持者”窦状毛细血管的功能尚未探索。在这里，作者发现对贝伐单抗耐药的CRCLM异种移植物中血管劫持的发生与肝星状细胞（HSC）中成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）的表达增加有关，在携带CRCLM同种异体移植物的HSC特异性条件FAP敲除小鼠中，FAPα的表达显著减弱。从机制上讲，贝伐单抗治疗可诱导缺氧上调肿瘤细胞中成纤维细胞生长因子结合蛋白1（FGFBP1）的表达。功能获得或丧失实验表明，贝伐单抗耐药肿瘤细胞来源的FGFBP1通过增强HSC旁分泌FGF2-FGFR1-ERK1/2EGR1信号通路诱导FAPα表达。FAPα促进HSC中CXCL5的分泌，从而激活CXCR2，促进肿瘤细胞的上皮-间充质转化（EMT）和髓源性抑制细胞（MDSC）的募集。这些发现在CRCLM患者来源的肿瘤组织中得到了进一步验证。以FAPα⁺HSC为靶点有效地破坏了被劫持的窦状毛细血管，克服了贝伐单抗的耐药性。作者的研究强调了FAPα⁺HSC在血管劫持中的作用，并为克服血管劫持介导的贝伐单抗耐药性提供了有效策略。

研究内容及结果

1.FAPα在贝伐单抗耐药的CRCLM异种移植模型被劫持窦状毛细血管的HSC中的表达

贝伐单抗敏感的HCT116 CRCLM异种移植模型小鼠给予贝伐单抗（10 mg/kg）处理42天生成获得性耐药模型。贝伐单抗固有耐药HT-29异种移植模型用贝伐单抗（10 mg/kg）治疗12天，以确认耐药情况（图1A）。

结果显示，空白组中HGP主要是DHGP和PHGP，耐药组肿瘤则以RHGP为主要形式（图1B）。同时，贝伐单抗获得性耐药HCT116 CRCLM异种移植模型中被劫持窦状毛细血管的数量显著高于空白组（图1C）。耐药组中被劫持窦状毛细血管的αSMA⁺HSC中均显示出FAPα染色。癌旁正常肝组织的HSC或CRCLM异种移植物中心区域的新生微血管中均未出现FAPα和αSMA染色（图1D）。

图1

2.FAPα诱导HSC分泌CXCL5以促进血管劫持

将具有贝伐单抗固有耐药性的MC38小鼠结肠腺癌细胞系直接注射到Fap野生型小鼠（Fapfl/fl）或HSC特异性条件Fap敲除小鼠（FapΔGfap）的肝实质，以生成固有贝伐单抗耐药的CRCLM同种移植物（图2A）。

结果表明，与Fapfl/fl小鼠相比，FapΔGfap小鼠的被劫持窦状毛细血管显著减少（图2，B和C）。作者推测FAPα⁺HSC可能预先建立免疫抑制微环境并诱导肿瘤细胞EMT促进血管劫持。与推测相符，Gr-1⁺MDSCs的募集被显著抑制（图2D），CD8⁺T细胞的出现显著增加（图2E），间充质标记物波形蛋白和N-神经钙粘附蛋白的表达降低，上皮标记物E-钙黏蛋白的表达增加（图2F）。

图2

  为了进一步研究FAPα在HSC调控的血管劫持中的机制，作者生成了FAPα稳定过表达的人肝星状细胞系LX-2和阴性对照细胞（LX-2^Vector）。结果表明，FAPα稳定过表达可提高编码分泌因子CSF2、IL18、CXCL5、IL33、IL1B和IL16的基因水平（图3A），CXCL5是很显著的上调基因（图3B）。ELISA检测表明，LX-2^FAP细胞培养上清液中的CXCL5水平明显高于LX-2^Vector细胞（图3C）。

鉴于肿瘤来源的CXCL5通过激活CXCR2促进肿瘤细胞EMT和MDSC募集，作者提出HSC来源的FAPα通过CXCL5-CXCR2轴促进肿瘤细胞的EMT和MDSC招募。作者发现，LX-2^FAP细胞的条件化培养基可刺激MDSCs和HCT116细胞内Ca²⁺动员的快速和短暂增加，增强了MDSC的迁移，促进了HCT116细胞的迁移和侵袭，增加了波形蛋白、N-钙粘蛋白和snail的表达，并降低了HCT116细胞中E-钙粘蛋白的表达（图3，E-G）。CXCL5中和抗体或SB225002（CXCR2抑制剂）可显著减弱这些效应（图3，D-G）。证实了FAPα诱导HSC分泌CXCL5，通过激活CXCR2促进肿瘤细胞EMT和MDSC的招募，从而促进血管的劫持作用。

图3

3.肿瘤细胞来源的FGFBP1诱导HSC中FAPα的表达以促进血管劫持

蛋白质组学分析表明，在贝伐单抗耐药肿瘤中发现了17种上调蛋白（图4A）。FGFBP1水平为很显著的上调基因，且表达量显著高于空白组（图4，B-D）。

在FGFBP1低表达HCT116细胞上建立FGFBP1过表达细胞系，在FGFBP1高表达HT-29细胞上建立FGFBP1抑制细胞系。结果表明，FGFBP1过表达可提高RHGP比率，而FGFBP1抑制表达可降低RHGP比率（图4E）。同样的，FGFBP1过表达组中被劫持窦状毛细血管的数量及HSCs中FAPα的表达均显著高于FGFBP1抑制组（图4F和G）。此外，FGFBP1过表达组中的MDSC的募集和肿瘤细胞EMT也更显著。综上所述，表明肿瘤细胞来源的FGFBP1诱导HSC中FAPα的表达并促进血管劫持。

图4

4.肿瘤细胞来源的FGFBP1通过FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1轴诱导HSC中FAPα的表达

FGFBP1可以通过从细胞外基质（ECM）释放FGF2来增强FGFR1信号的激活。作者提出HSC中FGFR1激活诱导的FAPα的表达可能受ERK1/2-GGR1轴调控。结果表明，使用FGFBP1过表达细胞的条件培养基处理的LX-2细胞中FGFR1和ERK1/2的磷酸化以及EGR1和FAPα的表达显著增加（图5A）。FGF2和FGFR1的抑制可显著减弱上述作用（图5，A和B）。此外，LY3214996（ERK1/2特异性抑制剂）治疗显著抑制了EGR1和FAPα的表达（图5C），而抑制EGR1显著降低了FAPα的表达（图5D）。

体内实验还表明，FGF2中和抗体或PD-166866（FGFR1特异性抑制剂）显著抑制FGFBP1过表达CRCLM异种移植物HSC中p-FGFR1、p-ERK1/2、EGR1和FAPα的表达（图5G和补充图8A）。这些数据表明，肿瘤细胞来源的FGFBP1通过FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1轴诱导HSC中FAPα的表达。

图5

5.贝伐单抗通过激活HSC中的FGF2-FGFR1-FAPα-CXCL5轴诱导血管劫持

贝伐单抗与FGF2中和抗体或PD-166866的联合应用显著抑制了贝伐单抗耐药HCT116和HT-29CRCLM异种移植物的肿瘤生长，并降低了MVD。同时也显著降低了RHGP的比率（图6A和补充图10A）和被劫持窦状毛细血管的数量（图6B和补充图10 B）。FGF2中和抗体和PD-166866均抑制HSC中p-FGFR1和FAPα的表达水平（图6C和补充图10C），抑制Gr-1⁺MDSC的募集（图6D和补充图10D），降低波形蛋白的表达，并增加肿瘤细胞中E-钙黏蛋白的表达（补充图10E）。这些数据表明，贝伐单抗通过激活FGFR1-FAPα轴促进肿瘤细胞EMT和MDSC募集而诱导血管劫持作用。

ELISA分析表明，FGFR1的抑制可显著降低CXCL5的表达（图6E），并且抑制了MDSC的迁移和HCT116细胞的迁移和侵袭（图6、F和G以及补充图11B），降低了波形蛋白、N-钙粘蛋白和snail的表达，增加了HCT116中E-钙粘蛋白的表达（图6H和补充图11C）。然而，FAPα的过度表达完整挽救了这些抑制作用（图6E-H）。这些发现表明，FGFR1激活可能依赖于FAPα诱导HSC分泌CXCL5，促进肿瘤细胞EMT和MDSC募集，从而促进血管劫持。

图6

6.贝伐单抗诱导的HSC中FAPα表达与CRCLM患者的血管劫持作用相关

如CRCLM患者的CT扫描所示（图7A），术前化疗联合贝伐单抗（Chemo+Bev）组治疗的患者DHGP或PHGP的病灶形态显著转化为RHGP，但单用化疗（Chemo）组的病灶形态不明显。组织病理学检查显示，DHGP和PHGP主要存在于Chemo的患者中，而Chemo+Bev治疗的患者主要含有RHGP（图7B）。

Chemo+Bev治疗的患者肿瘤中FGFBP1的表达比Chemo治疗的患者更强（图7C）。Chemo+Bev治疗患者被劫持窦状毛细血管和FAPα⁺HSC的数量增多（图7D），并且显示出更高的p-FGFR1水平（图7E）。此外，在CRCLM患者中，FAPα⁺HSC的数量与FGFBP1表达、被劫持窦状毛细血管或RHGP呈正相关（图7F）。患有RHGP的CRCLM患者对贝伐单抗的反应较差，这可以从接受Chemo+Bev治疗的患者的肿瘤负荷增加（与接受Chemo治疗的患者相似）得到证明（图7G）。综上所述，这些数据表明贝伐单抗治疗导致FGFBP1-FGFR1-FAPα轴激活，这可能是血管劫持介导贝伐单抗耐药性的原因。

图7

7.以FAPα⁺HSC为靶点破坏被劫持的窦状毛细血管以克服贝伐单抗耐药性

接下来，作者研究了利用Z-GP-DAVLBH（作者实验室合成的一种FAPα激活前体药物）在被劫持窦状毛细血管中以FAPα⁺HSC为靶点是否可以消除贝伐单抗诱导的血管劫持。结果表明，Z-GP-DAVLBH治疗在贝伐单抗耐药的HCT116和HT-29CRCLM异种移植物中均诱导肿瘤消退，如增加坏死面积（图8，A和B）和肿瘤组织中MVD减少（补充图12A）。

从机制上讲，Z-GP-DAVLBH治疗逆转了RHGP的发展（图8，A和B），减少了被劫持窦状毛细血管的数量（图8C），阻止了Gr-1⁺MDSC的募集，抑制了肿瘤细胞EMT。此外，还破坏了被劫持窦状毛细血管，导致肝脏肿瘤界面出血（补充图12E）。这种效应可能与Z-GP-DAVLBH诱导的被劫持窦状毛细血管中FAPα⁺HSC细胞凋亡有关（图8D）。最终，Z-GP-DAVLBH延长了HT-29和HCT116CRCLM异种移植小鼠的总存活时间（图8E）。这些数据表明，Z-GP-DAVLBH选择性诱导FAPα⁺HSC凋亡，破坏被劫持窦状毛细血管，并克服血管劫持介导的贝伐单抗治疗耐药性。

图8

结论

血管劫持是一种非血管生成依赖性现象，常见于肝癌、肺癌、肾癌和胶质母细胞瘤。越来越多的证据表明，血管劫持在介导抗血管生成治疗耐药中起着重要作用。目前，血管劫持的研究主要集中在“劫持者”肿瘤细胞上，而克服治疗耐药性的有效策略仍然缺乏。令人惊讶的是，“被劫持者”血管基质细胞在血管劫持中的作用在很大程度上仍然未知。在此，作者从“被劫持者”角度阐明了血管劫持的潜在机制，并揭示了克服血管劫持介导的CRCLM抗血管生成治疗耐药性的有效策略。贝伐单抗治疗诱导HSC中FAPα的表达，促进肿瘤细胞EMT和MDSC的募集，进而显著促进血管劫持。阻断FGFBP1-FGF2-FGFR1信号通路可抑制HSC中FAPα的表达，并减弱血管劫持，FAPα激活前药Z-GP-DAVLBH靶向FAPα+HSC可破坏被劫持窦状毛细血管，从而消除血管劫持，有效地克服了血管劫持介导的CRCLM对抗血管生成治疗的耐药性，为其提供了潜在的治疗策略和药物候选。

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