免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术，简称IF，是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种蛋白示踪技术。怎么才能得到别人那样颜色明亮多彩又好看精准的图片呢？让我们先来了解什么是免疫荧光双重染色吧！免疫荧光双重染色是使用携带有不同颜色荧光标记物的抗体对同一样本中的两种不同抗原进行区分和定位，也称免疫共染色。通常情况下，同时检测组织或细胞样本中的两个或多个抗原时，需要进行双重甚至多重染色。利用荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜可看见荧光所在的细胞或组织，进而确定抗原的性质和定位。

基本原理

根据抗原抗体特异性结合的反应原理，用已结合示踪荧光标记物（通常是荧光标记物或者荧光蛋白）的抗体直接或间接识别抗原，示踪物质显色的地方即是抗原的所在区域。

双重染色类型

依据与抗原直接结合的抗体（通常称之为一抗）是否带有荧光标记物可将实验分为直接法和间接法。

直接法

使用荧光标记物标记的一抗，直接与抗原反应。

优点：特异性强、实验简便快速；

缺点：抗体用量较大、灵敏度较低。

间接法

用未标记的一抗与抗原样本反应，然后孵育用于结合一抗的荧光标记物标记的二抗，形成抗原-一抗-二抗复合物。

优点：灵敏度高、节省抗体；

缺点：存在非特异性染色。

基本实验步骤

结果展示

图2 间接法免疫荧光双染结果

红色荧光-K107573P

绿色荧光-K200059M

注意事项

（1）每次实验均需设置阳性对照、阴性对照和荧光标记物对照；

（2）直接法双重染色要求一抗的荧光标记物激发波段不同，而间接法双重染色要求一抗不同种属以及二抗携带的荧光标记物激发波段不同；

（3）双染前，要对每个抗体进行单独染色，确定合适染色条件和抗体定位；

（4）注意组织切片或细胞爬片全程保持湿润；

（5）抗体孵育后，用PBS或其他洗涤液充分洗涤组织切片，去除多余抗体；

（6）对于背景较高的组织样本，做组织封闭后效果更好。

常用荧光标记物

北京索莱宝二抗种类（均可加标）

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