在中国，真正的思想家是门卫大爷，因为他每次都要问你哲学上的三个终极问题：“你是谁？”“你从哪里来？”“你要到哪里去？”。这三个问题不仅仅是门卫大爷在想，哲学家，科学家也都在思索与追溯。本着跟门卫大爷学习的态度，今天跟大家追溯的是索莱宝公司在做，植物领域科学家们用来进行植物基因功能研究的“螺旋桨”——植物抗体（Antibody for Plant Research）。

植物抗体的三个终极问题

◆ 植物抗体是什么？

植物抗体是植物细胞自身合成与分泌的物质吗？还是动物细胞合成与分泌的物质，可用于特异性结合植物蛋白或多肽等？

答案显然是后者。虽然植物具有和人/动物类似的先天免疫系统（innate immune system），比如PTI、ETI，但是还没有研究报道，植物拥有类似于人/动物的获得性免疫系统（adaptive immune system）。尤其是，还没发现类似于人/动物B淋巴细胞或浆细胞的植物细胞，因而植物不能同人或动物那样产生并分泌抗体。

图1  植物抗体分子结构模型

一般而言，抗体是人体或脊椎动物获得性免疫系统中浆细胞产生的免疫球蛋白，其产生需要细菌、病毒、植物蛋白等抗原物质的诱导与刺激，是由两条相同的重链与两条相同的轻链构成的“Y”字形结构分子（如图1）。那么植物抗原与植物抗体的关系是怎样的呢？我们知道，目前世界各地都在为获取充足的新冠疫苗而努力，使人体产生对抗新冠病毒的抗体，因而，植物抗原与植物抗体的关系就如同COVID-19灭活疫苗与人体分泌的COVID-19抗体。要想进一步深入理解植物抗体是什么，还有赖于对后面两个终极问题的认识与理解。

◆ 植物抗体从哪里来？

正如注射新冠疫苗使人体产生对抗病毒的抗体，植物抗体的获得同样需要制备植物蛋白或多肽等，用于免疫动物（小鼠、兔子等），使其合成并分泌对抗对应的植物抗原的抗体。那么植物抗体产生的一般过程又是怎样的？

首先，根据植物基因/蛋白注释数据库（比如，Uniprot、NCBI、TAIR、MSU-RGAP、Gramene等），获取对应的植物蛋白/多肽的全长氨基酸序列及其相关信息（比如，同源蛋白、可变剪切体、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构域、修饰化位点等）。利用Swiss-Model、TMHMM、IEDB、abcpred、AbDesigner、DNAstar等软件与分析工具，预测蛋白质三维结构并获取抗原表位信息，从而选择与设计出具有较强抗原性的氨基酸序列片段，用于制备重组蛋白（长度＞100 aa；通常利用E.coli等原核生物表达产生）或合成多肽（长度10-22 aa）并与载体耦联（如KLH-多肽）。

图2  植物抗体制备流程（鼠单抗或兔多抗）

以上述重组蛋白或KLH-多肽等作为植物抗原（或免疫原），对小鼠或兔子等动物进行注射免疫，以获取特异性植物抗体。通常选择小鼠用于制备单克隆抗体，选择兔子、羊等用于制备多克隆抗体。与多克隆抗体制备所不同的是，单克隆抗体需要效应B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的过程，以获得具有无限增殖能力的杂交瘤细胞；并进行亚克隆筛选，获取可产生单克隆抗体的阳性细胞株；然后将阳性细胞株注射到小鼠腹腔，以诱生大量单克隆抗体；随后大量采集小鼠腹水，从中分离、纯化抗体，并对抗体的质量与应用范围进行验证评估。而多抗制备则是在动物免疫后，采集分离血清，分离纯化抗体，并做应用验证即可。

◆ 植物抗体要到哪里去？

从新冠肺炎康复患者体内分离的血清可用于治疗新感染COVID-19的病人，换言之，COVID-19抗体可以用于抵抗与消灭新冠病毒，避免感染新冠肺炎。然而，制备植物抗体的目的，却并不是用于或为了消灭植物蛋白或多肽等。在科研领域内，最直接目的是用于识别与鉴定植物蛋白，以实现目的蛋白质的定性/定量、亚细胞定位、蛋白质互作、蛋白质与核酸互作等（可继续关注后续推文分享~），因而，植物抗体一般被用于WB、IP/Co-IP/IP-MS、Pull-down、免疫金标记、CHIP/CHIP-seq、ELISA等实验中。

下面以水稻线粒体蛋白ATP合酶β亚基（AtpB | Beta subunit of  ATP synthase）为例，介绍索莱宝公司自产的一支植物抗体anti-AtpB的诞生过程：

背景介绍

线粒体内膜表面有一层规则间隔排列着的球状颗粒，称为ATP酶复合体，即ATP合酶，是ATP（生命活动的能量“货币”）合成的场所。它主要由伸在膜外的亲水部分F1（α₃β₃γδε亚基）和嵌入膜内的疏水部分F0（a₁b₂c_9-12亚基）两部分组成（图3）。

图3  ATP合酶及ATP合成

在水稻中，ATP合酶β亚基的编码基因为LOC_Os05g47980，由9个exons与8个内含子构成，CDS全长为1659 nt，蛋白长度552 aa，其亚细胞定位于线粒体内膜。利用Swiss-Model预测其蛋白三维结构（图4），IEDB等预测抗原表位密集的肽段，选择并设计目标序列片段，用于重组蛋白表达，表达得到的蛋白免疫小鼠，以制备单克隆抗体。

图4  水稻AtpB的基因结构

及蛋白的亚细胞定位与3D结构预测模型

抗体制备及抗体Anti-ATPB信息

索莱宝公司根据MSU-RGAP与Uniprot注释的基因/蛋白序列信息，将设计出具有较强抗原性的序列片段通过原核生物表达获得重组蛋白，然后以此作为免疫原，对小鼠进行免疫，并将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得单克隆杂交瘤细胞，最终生产纯化获得高效价的单克隆植物抗体Anti-ATPB。

单抗Anti-ATPB的WB检测结果（如图5）

图5  Anti-ATPB检测结果

反应条件详细信息：

蛋白样品：每孔25 μg总蛋白（加样顺序：水稻、拟南芥、玉米、大豆、烟草、小麦的叶片）

分离胶浓度：10% SDS-PAGE

转膜：PVDF（0.45μm）转膜1 hour

封闭：5%脱脂牛奶（室温或4℃，1 hour）

一抗：4℃过夜，1:1000

二抗：室温1小时，1:2000

曝光：ECL发光液

结论：利用水稻蛋白AtpB作为免疫原，获得的抗体Anti-AtpB，不仅在水稻中，而且在其它植物，如拟南芥、玉米、大豆、烟草、小麦等均有反应。表明此抗体在不同作物中具有广泛的用途。

植物抗体定制服务

大多数植物蛋白缺乏可用抗体，需要量身定制抗体。为满足科研工作者对抗体多样化和深层次的科研需求，索莱宝提供从植物基因到科研抗体的制备与后续检测验证等一站式、全方位的解决方案与定制服务。本服务项目依托于先进的研发平台，专业的服务开发团队和国际知名品牌的仪器设备，为客户植物抗体的定制与检测服务提供了保障。

备注：以上每项服务既是独立分项，可独立完成；又是一站式全套服务，可打包整合为一整套的整体服务项目来完成。

多肽自产抗体及制备过程实例，可关注后续推文。

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