大家好，小编又又又来了。今天是WB最后一步了，抗体孵育到显影过程。

01一抗孵育

◆ 封闭结束前20min准备和所需一抗数量相等的孵育盒，在孵育盒上用记号笔标注出抗体编号及所需稀释比。按照规定的稀释比例进行抗体稀释。稀释比例建议预实验提前摸索或者根据抗体说明书上建议。

◆ 封闭时间结束之后，倒掉封闭液，将稀释好的抗体加入到槽内，将摇床放入4℃展示柜孵育过夜。

◆ 第二天将摇床搬出，平衡室温摇15min，倒掉一抗工作液，加入5mL TBST润洗膜一次，倒掉，加新的TBST洗膜5min，倒掉TBST，重复5次，此过程在摇床上进行。

02二抗孵育

◆ 在洗膜的过程中稀释二抗，确定好一抗的物种来源，选择相应的二抗进行稀释，稀释液为1xTBST。

◆ 洗膜结束，倒掉TBST，尽量使孵育盒内无残留液体。然后加入二抗稀释液，孵育60min，此过程在摇床上进行。

◆ 二抗孵育60min后，加入5mL TBST洗膜，“SPEED”档位调到50-60，洗膜5min，倒掉TBST，重复5次。

03显影

按照膜的大小，配置ECL发光液体积，将发光液放在PE手套上，充分混匀。将膜从孵育盒中夹出，用纸沾干，放入发光液中5秒后用纸沾干，放入成像仪中曝光成像。

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